ni selife ®Medios cromatográficos de afinidad 6FF (IDA)

Resina de cromatografía de agarosa quelante de níquel

Instrucciones de Ni Seplife 6FF (IDA)

ni selife ® Perfil del producto de medios cromatográficos de afinidad 6FF (IDA):

Cromatografía de agarosa quelante de Ni  (IDA) se une al ácido iminodiacético en medios de agarosa 6FF y luego quela el ion Ni2+ para que sea como un  medios cromatográficos de afinidad . Es ampliamente utilizado para el  procesamiento de proteínas ,  ácido nucleico  y  purificación de polipéptidos  en corriente abajo de  biofarmacia y bioingeniería .

ni selife ® Parámetros de la resina del medio cromatográfico de afinidad 6FF (IDA):

ni selife ® Instrucción de prueba de medios cromatográficos de afinidad 6FF (IDA):

1.Embalaje de columnas
(1) Todo el material y el reactivo a temperatura ambiente, preparando el tampón inicial y el filtro de elución.
(2) Tome una muestra de resina según el tamaño de la columna, lave con etanol al 20% para secar, use un tampón (la proporción de resina: tampón = 3:1) para homogeneizar y realizar un tratamiento de desgasificación.
(3) Utilice agua o amortiguador para mantener húmedo el interior o el fondo de la columna. El nivel de agua o amortiguador debe ser más alto que el de la membrana del filtro y asegúrese de que el fondo de la columna no tenga burbujas.
(4) Utilice una varilla de vidrio para guiar el homogeneizado hacia la columna junto con la cara interna de la columna una vez para evitar burbujas. Abra la válvula de salida de la columna para que la resina se asiente libremente y conecte bien la tapa superior de la columna.
(5) Abra la bomba peristáltica, use el tampón para pasar a través de la columna a un caudal de 1,33 veces mayor que el caudal del tampón de uso normal. Utilice un búfer 2-3BV para equilibrar las columnas.
2.Equilibrio
Equilibre con 2 a 5 volúmenes de lecho de solución tampón inicial hasta que la conductividad, el pH y otros parámetros no cambien.
3.Carga de muestra
(1) La muestra generalmente se disuelve en el tampón inicial de pH 6-8, y aumentar el pH del tampón de carga puede aumentar la carga.
(2) El tampón no debe contener EDTA ni citrato, y es mejor evitar agentes reductores como el mercaptoetanol y el DTT.
(3) La solución tampón comúnmente utilizada tiene una solución tampón de fosfato de sodio de 10 a 100 mmol/l y una solución tampón de 20 a 200 mmol/LTris-HCl.
(4) Generalmente se añaden de 0,15 a 0,5 mol/L de NaCl al tampón para eliminar el intercambio iónico.
(5) Cuando utilice un gel de agarosa quelato de níquel por primera vez, se recomienda utilizar PBS 50 mmol/L (NaH2PO4 50 mmol/L, NaCl 0,5 mol/L, pH 7,4) como tampón inicial.
4.Elución
La elución generalmente se divide en los siguientes métodos:
(1) Reducir elución con pH: la mayoría de las proteínas se eluirán a pH 6-4 (también a pH 3-4), y el tampón puede ser sistemas tampón de acetato de sodio, ácido cítrico y fosfato.
(2) Elución competitiva: aumentar o aumentar linealmente la concentración de sustancias competitivas con afinidad por los iones metálicos (por ejemplo, 0-0,5 mol/l de imidazol, 0-50 mmol/l de histidina, 0-2 mol/l de NH4Cl).
(3) Elución del agente quelante: los agentes quelantes como EDTA y EGTA pueden reaccionar con iones metálicos para hacer que la proteína eluya. Sin embargo, este método no puede separar diferentes proteínas y afecta la adsorción de proteínas, lo que resulta en la incapacidad de la proteína de fusión para colgarse.

ni selife ® Observaciones sobre los medios cromatográficos de afinidad 6FF (IDA):

(1) Cuando se usa por primera vez, si la concentración de imidazol requerida para la elución es incierta, se recomienda agregar 10 mmol/L, 20 mmol/L, 50 mmol/L, 100 mmol/L, 200 mmol/L, 500 mmol/L a el buffer inicial. El imidazol se eluyó y se recogió de menor a mayor, respectivamente, y los resultados eluidos se identificaron mediante electroforesis SDS-PAGE.
(2) El imidazol es alcalino y el pH se ajusta con HCl después de preparar el tampón correspondiente.
(3) Reducir el pH de elución y eluir el agente quelante hará que los iones metálicos se caigan y será necesario volver a quelarlos antes del siguiente uso.
(4) Condicionalmente, se puede realizar una elución lineal en gradiente de imidazol para determinar las condiciones de elución preferidas.
Para los métodos de elución anteriores, se deben agregar de 150 a 500 mmol/L de NaCl al tampón para eliminar el intercambio iónico.
5.Regeneración
(1) El gel debe ser despuntado y regenerado después de un uso repetido o cuando sea necesario reemplazar los iones metálicos quelados. Método de eliminación de níquel: primero enjuague la columna con 5 a 10 volúmenes de lecho de agua destilada, luego enjuague la columna con 5 a 10 volúmenes de lecho de 100 mmol/L de EDTA y finalmente use 2 a 3 volúmenes de lecho de lavados de 0,5 mol/L de NaCl. eliminar el EDTA residual.
(2) La columna utilizada varias veces generalmente debe limpiarse después de eliminar el níquel. Método de limpieza: Invierta la columna con 0,1~1,0 mol/L de NaOH, manténgala a 50 cm/h durante 1~2 h, no sólo puede eliminar las impurezas fuertes, sino también eliminar la fuente de calor.
(3) Requelación de iones metálicos después de la limpieza. Método de quelación: en primer lugar, la columna después de la eliminación del níquel se equilibra completamente con 2 a 5 volúmenes de lecho de agua destilada, y luego se utiliza una solución de sal metálica de 0,1 a 0,3 mol/L para pasar de 5 a 10 volúmenes de lecho para quelar iones metálicos. Enjuague con 5 a 10 volúmenes de lecho de agua destilada para eliminar los iones metálicos no quelados.
6.CIP
(1) Eliminación de proteínas adsorbidas mediante intercambio iónico: se lavaron de 2 a 3 volúmenes de lecho con una solución de NaCl de 2 mol/l.
(2) Eliminación de proteínas y lípidos hidrófobos fuertes, etc.: se lavaron 4 volúmenes de lecho con etanol al 70 % o isopropanol al 30 %.
(3) Eliminación de proteína precipitada, proteína hidrófoba: paso de regeneración del gel de referencia.
7.Almacenamiento
Sellado y almacenado a 4 ~ 30 掳 C (etanol al 20% en solución de almacenamiento), seco, ventilado, limpio, no congelado; Las columnas usadas se almacenan en una solución de etanol al 20% a 4~8°C.

Precaución:
(1) La muestra y Ni seplife ®6FF (IDA) debe equilibrarse con el tampón de elución y luego pasar a columna de cromatografía.
(2) El lecho de la columna debe ser plano, libre de ranuras y burbujas de aire; de ​​lo contrario, deberá reinstalarse.
(3) Al usarlo, asegúrese de que la temperatura de la columna y el tampón sean las mismas, evitando la generación de burbujas en el lecho de la columna y afectando el efecto de purificación.
(4) El caudal debe controlarse estrictamente durante el proceso de elución y no demasiado rápido.
(5) Durante la carga y todo el proceso de elución, se evita que la superficie del cilindro se seque.