Ni Seplife ®Medio cromatográfico de afinidad 6FF (IDA)

Resina de cromatografía de agarosa quelante de níquel

Instrucciones de Ni Seplife 6FF (IDA)

Ni Seplife ® Perfil del producto del medio cromatográfico de afinidad 6FF (IDA):

Cromatografía de agarosa quelante de Ni  (IDA) se une al ácido iminodiacético en un medio de agarosa 6FF y luego se quela el ion de Ni2+ para que sea un  medios cromatográficos de afinidad Se utiliza ampliamente para la  procesamiento de proteínas ,  ácido nucleico  y  purificación de polipéptidos  En la parte baja de  biofarmacia y bioingeniería .

Ni Seplife ® Parámetros de la resina del medio cromatográfico de afinidad 6FF (IDA):

Ni Seplife ® 6FF (IDA) Instrucciones de prueba de medios cromatográficos de afinidad:

1. Empaquetamiento de columnas
(1)Todo el material y reactivo a temperatura ambiente, preparando el tampón inicial y la elución antes.
(2) Tome una muestra de resina según el tamaño de la columna, lave con etanol al 20 % para secar, use un tampón (la proporción de resina: tampón = 3:1) para homogeneizar y realizar un tratamiento de desgasificación.
(3) Use agua o tampón para mantener húmedo el interior o el fondo de la columna; el nivel del agua o del tampón debe ser más alto que la membrana del filtro y asegúrese de que el fondo de la columna no tenga burbujas.
(4) Utilice una varilla de vidrio para guiar el homogeneizado hacia la columna, a lo largo de su cara interna, una vez para evitar la formación de burbujas. Abra la válvula de salida de la columna para que la resina se asiente libremente y conecte bien la tapa superior de la columna.
(5) Abra la bomba peristáltica y utilice el tampón para que pase por la columna a un caudal 1,33 veces superior al del tampón de uso normal. Utilice tampón de 2-3 BV para equilibrar la columna.
2. Equilibrio
Equilibrar con 2~5 volúmenes de lecho de solución tampón inicial hasta que la conductividad, el pH y otros parámetros no cambien.
3. Carga de muestra
(1) La muestra generalmente se disuelve en el tampón inicial de pH 6-8, y aumentar el pH del tampón de carga puede aumentar la carga.
(2)El tampón no debe contener EDTA ni citrato, y es mejor evitar agentes reductores como mercaptoetanol y DTT.
(3) La solución tampón comúnmente utilizada tiene de 10 a 100 mmol/L de solución tampón de fosfato de sodio y de 20 a 200 mmol/L de solución tampón de Tris-HCl.
(4) Generalmente se añaden entre 0,15 y 0,5 mol/L de NaCl al tampón para eliminar el intercambio iónico.
(5) Cuando se utiliza por primera vez un gel de agarosa con quelato de níquel, se recomienda utilizar 50 mmol/L de PBS (50 mmol/L de NaH2PO4, 0,5 mol/L de NaCl, pH 7,4) como tampón inicial.
4.Elución
La elución generalmente se divide en los siguientes métodos:
(1) Reducir el pH de la elución: la mayoría de las proteínas se eluirán a un pH de 6-4 (también a un pH de 3-4) y el tampón puede ser acetato de sodio, ácido cítrico y sistemas de tampón de fosfato.
(2)Elución competitiva: aumento lineal o incremento de la concentración de sustancias competidoras con afinidad por los iones metálicos (por ejemplo, 0-0,5 mol/L de imidazol, 0-50 mmol/L de histidina, 0-2 mol/L de NH4Cl).
(3) Elución con agente quelante: Agentes quelantes como el EDTA y el EGTA pueden reaccionar con iones metálicos para provocar la elución de la proteína. Sin embargo, este método no permite separar proteínas diferentes y afecta la adsorción de proteínas, lo que impide que la proteína de fusión se adhiera.

Ni Seplife ® 6FF (IDA) Medios cromatográficos de afinidad Observaciones:

(1) Al utilizar por primera vez, si no se conoce la concentración de imidazol necesaria para la elución, se recomienda añadir 10 mmol/L, 20 mmol/L, 50 mmol/L, 100 mmol/L, 200 mmol/L y 500 mmol/L al tampón inicial. El imidazol se eluyó y se recogió de menor a mayor concentración, respectivamente, y los resultados eluidos se identificaron mediante electroforesis SDS-PAGE.
(2)El imidazol es alcalino y el pH se ajusta con HCl después de preparar el tampón correspondiente.
(3)Reducir el pH de la elución y eluir el agente quelante provocará que los iones metálicos se desprendan, y será necesario volver a quelarlos antes del próximo uso.
(4)Condicionalmente, se puede realizar una elución lineal con gradiente de imidazol para determinar las condiciones de elución preferidas.
Para los métodos de elución anteriores, se deben agregar de 150 a 500 mmol/L de NaCl al tampón para eliminar el intercambio iónico.
5.Regeneración
(1) El gel debe eliminarse y regenerarse después de un uso repetido o cuando sea necesario reemplazar los iones metálicos quelados. Método de eliminación de níquel: primero, enjuague la columna con 5 a 10 volúmenes de lecho de agua destilada, luego con 5 a 10 volúmenes de lecho de EDTA 100 mmol/L y, finalmente, utilice 2 a 3 volúmenes de lecho de NaCl 0,5 mol/L para eliminar el EDTA residual.
(2) La columna que se utiliza varias veces generalmente debe limpiarse después de la eliminación del níquel. Método de limpieza: Invierta la columna con 0,1-1,0 mol/L de NaOH y manténgala a 50 cm/h durante 1-2 h. Esto no solo elimina las impurezas fuertes, sino que también elimina la fuente de calor.
(3) Requelación de iones metálicos tras la limpieza. Método de quelación: Primero, tras la eliminación del níquel, la columna se equilibra completamente con 2 a 5 volúmenes de lecho de agua destilada. A continuación, se utiliza una solución de sal metálica de 0,1 a 0,3 mol/L para quemar los iones metálicos en 5 a 10 volúmenes de lecho. Se enjuaga con 5 a 10 volúmenes de lecho de agua destilada para eliminar los iones metálicos no quelados.
6.CIP
(1)Eliminación de proteínas adsorbidas por intercambio iónico: de 2 a 3 volúmenes del lecho se lavaron con una solución de NaCl de 2 mol/L.
(2)Eliminación de proteínas y lípidos fuertemente hidrófobos, etc.: se lavaron 4 volúmenes de lecho con etanol al 70 % o isopropanol al 30 %.
(3)Eliminación de proteína precipitada, proteína hidrófoba: paso de regeneración del gel de referencia.
7. Almacenamiento
Sellado y almacenado a 4~30 °C (20 % de etanol en solución de almacenamiento), seco, ventilado, limpio, no congelado; las columnas usadas se almacenan a 4~8 °C, solución de etanol al 20 %.

Precaución:
(1) La muestra y la vida útil del Ni ®6FF (IDA) debe equilibrarse con el tampón de elución y luego pasar a la columna de cromatografía.
(2)El lecho de la columna debe ser plano, libre de ranuras y burbujas de aire, de lo contrario deberá reinstalarse.
(3) Durante el uso, asegúrese de que la temperatura de la columna y del tampón sean las mismas, evitando la generación de burbujas en el lecho de la columna y afectando el efecto de purificación.
(4)El caudal debe controlarse estrictamente durante el proceso de elución y no ser demasiado rápido.
(5)Durante la carga y todo el proceso de elución, se evita que la superficie del cilindro se seque.