Selección de medios de cromatografía de intercambio iónico

El proceso de separación y purificación de biomacromoléculas mediante cromatografía de intercambio iónico se realiza principalmente aprovechando las propiedades de disociación de diversas moléculas, la carga neta de los iones y la diferencia eléctrica en la distribución de la carga superficial. Se ha convertido en una de las técnicas de purificación más utilizadas para la separación y purificación de bioquímicos, proteínas, péptidos y otras sustancias.

En la separación y purificación, se requiere que la columna tenga una alta capacidad de carga, sea fácil de operar y tenga una larga vida útil. El medio de separación es el factor más importante. Por lo tanto, su selección es particularmente importante.
 

1. Selección de variedades:

Un adecuado  medio de cromatografía de intercambio iónico  Debe seleccionarse según el tipo de carga, el tamaño de la molécula, las propiedades fisicoquímicas y el microambiente del producto objetivo a separar y purificar. Para moléculas pequeñas inorgánicas, la elección del medio de separación es relativamente sencilla, pero para las biomacromoléculas se deben considerar más factores.

Las biomacromoléculas, como las proteínas, se componen de diversos aminoácidos, que presentan diferentes propiedades eléctricas en diferentes condiciones de pH. Cada biomacromolécula tiene requisitos específicos para el entorno de pH más adecuado. Por lo tanto, es necesario comprender primero la proteína diana, etc. El punto eléctrico y el microambiente adecuados, según estas condiciones, permiten seleccionar la especie de intercambiador iónico adecuada.

La elección de un intercambiador catiónico o aniónico depende principalmente de la carga del material separado a su pH estable. Si tiene carga positiva, se selecciona el intercambiador catiónico; si tiene carga negativa, se selecciona el intercambiador aniónico. Por ejemplo, si el punto isoeléctrico de la proteína a separar es 4 y el rango de pH estable es de 6 a 9, la proteína tiene carga negativa en este momento, por lo que se debe seleccionar un intercambiador aniónico para la separación.
 

2. Selección de esqueleto: 

El intercambiador de iones de matriz (matriz) apropiado debe seleccionarse de acuerdo con el rendimiento del producto objetivo, la pureza requerida y el valor económico.

La resina de intercambio iónico de poliestireno de uso general se caracteriza por su estructura estable, bajo precio y alta capacidad de intercambio total, lo que la hace adecuada para la extracción y separación de productos bioquímicos generales, como antibióticos, ácidos orgánicos y recursos animales o vegetales. Para algunos productos de ingeniería genética de alto valor añadido que requieren alta resolución y pureza, se siguen necesitando medios de separación bioquímica a base de celulosa, dextrano y agarosa.

Los intercambiadores de iones de celulosa son relativamente económicos, pero presentan baja resolución y estabilidad, y son adecuados para la separación inicial y la preparación a granel. La resolución y el precio del intercambiador de iones de dextrano son moderados, pero la influencia externa es importante, y el volumen puede variar considerablemente con la variación de la fuerza iónica y el pH, lo que afecta la resolución. Los intercambiadores de iones de agarosa presentan buena estabilidad mecánica y alta resolución, pero son más caros.

El medio de separación ideal no solo debe adsorberse fácilmente, sino también ser fácil de eluir. Si el producto objetivo no es sensible a los cambios de fuerza iónica ni de pH, se puede considerar un medio fuerte con una carga fuerte o una alcalinidad fuerte con una alta densidad de carga. Si estos factores son sensibles, se deben utilizar medios débiles o ligeramente alcalinos. Si la sustancia macromolecular se adsorbe, la combinación es relativamente fuerte y, a menudo, difícil de eluir. Si se utilizan condiciones severas que provoquen la desnaturalización de las macromoléculas, se debe seleccionar un medio con una baja densidad de grupos funcionales.

Medio fuertemente ácido o fuertemente alcalino con un amplio rango de pH. Se utiliza a menudo para separar moléculas pequeñas o a pH extremos. Sin embargo, debido a sus fuertes propiedades eléctricas, a veces se desnaturaliza fácilmente o pierde algunas biomoléculas sensibles. Los medios débilmente ácidos o débilmente alcalinos tienen un amplio rango de selectividad y no son fáciles de inactivar proteínas. Por lo tanto, generalmente son adecuados para separar macromoléculas como las proteínas, pero su rango de pH es estrecho.
 

3. Selección del tamaño de partícula:

El tamaño del medio de separación influye significativamente en la resolución y el caudal de la columna de cromatografía de intercambio iónico. Generalmente, el medio de separación presenta un tamaño de partícula pequeño y una alta resolución, pero el ion de equilibrio presenta un tiempo de equilibrio prolongado y un caudal lento. Cuando el tamaño de partícula es grande, la columna presenta un caudal relativamente rápido y una pequeña caída de presión, pero la resolución es baja y la carga es reducida. Por lo tanto, el medio de separación de partículas grandes es adecuado para la separación preparativa a gran escala, que no requiere resolución, y el medio de separación de partículas pequeñas es adecuado para la separación fina que requiere alta resolución o la etapa de refinación del producto.