El proceso de separación y purificación de biomacromoléculas por cromatografía de intercambio iónico se lleva a cabo principalmente mediante el uso de las propiedades de disociación de varias moléculas, la carga neta de iones y la diferencia eléctrica de distribución de carga superficial. Se ha convertido en una de las técnicas de purificación más utilizadas para la separación y purificación de bioquímicos, proteínas, péptidos y otras sustancias.
En la separación y purificación, se requiere que la columna tenga alta capacidad de carga, fácil operación y larga vida útil. El medio de separación es el factor más importante. Por tanto, la selección del medio de separación es particularmente importante.
1. Selección de variedades:
Una adecuadamedio de cromatografía de intercambio iónicodebe seleccionarse de acuerdo con el tipo de carga, el tamaño de la molécula, las propiedades fisicoquímicas y el microambiente del producto objetivo a separar y purificar. Para moléculas pequeñas inorgánicas, la elección del medio de separación es relativamente fácil, pero se deben considerar más factores para las biomacromoléculas.
Las biomacromoléculas, como las proteínas, están compuestas por una variedad de aminoácidos, que exhiben diferentes propiedades eléctricas en diferentes condiciones de pH, y las biomacromoléculas tienen requisitos específicos para el entorno de pH más adecuado. Por lo tanto, es necesario comprender primero la proteína diana, etc. El punto eléctrico y el microambiente apropiado, de acuerdo con estas condiciones, seleccionan la especie intercambiadora de iones adecuada.
La elección de un intercambiador de cationes o de un intercambiador de aniones depende principalmente de la carga del material separado a su pH estable. Si está cargado positivamente, se selecciona el intercambiador de cationes; si está cargado negativamente, se selecciona el intercambiador de aniones. Por ejemplo, el punto isoeléctrico de la proteína a separar es 4 y el rango de pH estable es 6-9. Dado que la proteína está cargada negativamente en este momento, se debe seleccionar un intercambiador de aniones para la separación.
2. Selección de esqueleto:
El intercambiador de iones de matriz (matriz) apropiado debe seleccionarse de acuerdo con el rendimiento del producto objetivo, la pureza requerida y el valor económico.
La resina de intercambio iónico de poliestireno de uso general tiene las características de estructura estable, precio bajo, alta capacidad de intercambio total, y es adecuada para el proceso de extracción y separación de productos bioquímicos generales como antibióticos, ácidos orgánicos, recursos animales o recursos vegetales. Para algunos productos de ingeniería genética de alto valor agregado que requieren alta resolución y alta pureza del producto, todavía se necesitan medios de separación bioquímicos basados en celulosa, dextrano y agarosa.
Los intercambiadores de iones de celulosa son relativamente económicos, pero tienen baja resolución y estabilidad y son adecuados para la separación inicial y la preparación a granel. La resolución y el precio del intercambiador de iones dextrano son moderados, pero la influencia externa es grande y el volumen puede cambiar mucho con el cambio de la fuerza iónica y el pH, afectando la resolución. Los intercambiadores de iones de agarosa tienen buena estabilidad mecánica y alta resolución, pero son más caros.
El medio de separación ideal no solo debe ser fácilmente adsorbido, sino también fácil de eluir. Si el producto objetivo no es sensible a los cambios en la fuerza iónica y el pH, se puede considerar un medio fuerte con una carga fuerte o alcalinidad fuerte con una densidad de carga alta. Si estos factores son sensibles, se deben utilizar medios débiles débiles o débilmente alcalinos. Si se adsorbe la sustancia macromolecular, la combinación es relativamente fuerte y, a menudo, es difícil de eluir. Si se utilizan condiciones rigurosas para provocar la desnaturalización de las macromoléculas, debe seleccionarse un medio con una densidad de grupos funcionales baja.
Medio fuertemente ácido o fuertemente alcalino con un amplio rango de pH. A menudo se utiliza para separar moléculas pequeñas o separar a pH extremo. Sin embargo, debido a sus fuertes propiedades eléctricas, a veces se desnaturaliza fácilmente o pierde en vivo algunas biomoléculas sensibles. Los medios débiles débilmente ácidos o débilmente alcalinos tienen una amplia gama de selectividad y no son fáciles de inactivar las proteínas. Por lo tanto, generalmente son adecuados para separar macromoléculas como proteínas, pero su rango de pH es estrecho.
3. Selección del tamaño de partícula:
El tamaño del medio de separación tiene un efecto significativo sobre la resolución y el caudal de la columna de cromatografía de intercambio iónico. Generalmente, el medio de separación tiene un tamaño de partícula pequeño y una alta resolución, pero el ión de equilibrio tiene un tiempo de equilibrio largo y un caudal lento; cuando el tamaño de partícula es grande, la columna tiene un caudal relativamente rápido y una pequeña caída de presión, pero la resolución es baja y la carga es pequeña. Por lo tanto, el medio de separación de partículas grandes es adecuado para la separación preparativa a gran escala que no se requiere para la resolución, y el medio de separación de partículas pequeñas es adecuado para la separación fina que requiere una alta resolución o una etapa de refinado del producto.
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