Ni Seplife® 6FF (IDA)

Resina de cromatografía de agarosa quelante de níquel

Instrucciones de Ni Seplife 6FF (IDA)

Perfil del producto:
Cromatografía de agarosa quelante de Ni(IDA) se une al ácido iminodiacético en medio de agarosa 6FF y luego quela el ion de Ni2 + para que sea como unmedios cromatográficos de afinidad. Es ampliamente utilizado paraprocesamiento de proteína,ácido nucleicoypurificación de polipéptidosen corriente abajo debiopharming y bioingeniería.

Parámetros de resina:

Instrucción de prueba:
1.Embalaje de columna
(1) Todo el material y reactivo a temperatura ambiente, preparando tampón inicial y beffer de elución.
(2) Tome una muestra de resina según el tamaño de la columna, lave con etanol al 20% para secar, use tampón (la proporción de resina: tampón = 3: 1) para hacer un tratamiento de homogeneización y desgasificación.
(3) Use agua o tampón para mantener húmedo el interior o el fondo de la columna, el nivel de agua o tampón debe ser más alto que el de la membrana del filtro y asegúrese de que el fondo de la columna no tenga burbujas.
(4) Use una varilla de vidrio para guiar el homogeneizado hacia la columna junto con la cara interna de la columna una vez para evitar cualquier burbuja. Abra la válvula de salida de la columna para que la resina se asiente libremente y conecte bien la tapa superior de la columna.
(5) Abra la bomba peristáltica, use el tampón para pasar a través de la columna a una tasa de flujo de 1,33 veces mayor que la tasa de flujo del tampón que usa normalmente. Utilice tampón 2-3BV para equilibrar la columna.
2.Equilibrio
Equilibre con 2 ~ 5 volúmenes de lecho de solución tampón inicial hasta que la conductividad, el pH y otros parámetros no cambien.
Carga 3.Sample
(1) La muestra generalmente se disuelve en el tampón inicial de pH 6-8, y el aumento del pH del tampón de carga puede aumentar la carga.
(2) El tampón no debe contener EDTA ni citrato, y es mejor evitar agentes reductores como el mercaptoetanol y el DTT.
(3) La solución tampón de uso común tiene de 10 a 100 mmol / L de solución tampón de fosfato de sodio, 20 a 200 mmol / solución tampón LTris-HCl.
(4) Generalmente se añaden 0,15 a 0,5 mol / L de NaCl al tampón para eliminar el intercambio iónico.
(5) Cuando se utiliza un gel de agarosa quelato de níquel por primera vez, se recomienda utilizar 50 mmol / L de PBS (50 mmol / L de NaH2PO4, 0,5 mol / L de NaCl, pH 7,4) como tampón inicial.
4 elución
La elución se divide generalmente en los siguientes métodos:
(1) Reducir la elución del pH: la mayoría de las proteínas se eluirán a pH 6-4 (también a pH 3-4), y el tampón puede ser acetato de sodio, ácido cítrico y sistemas tampón de fosfato.
(2) Elución competitiva: aumentar o aumentar linealmente la concentración de sustancias competidoras con afinidad por los iones metálicos (p. Ej. 0-0,5 mol / L de imidazol, 0-50 mmol / L de histidina, 0-2 mol / L de NH4Cl).
(3) Elución del agente quelante: los agentes quelantes como EDTA y EGTA pueden reaccionar con iones metálicos para provocar la elución de la proteína. Sin embargo, este método no puede separar diferentes proteínas y afecta la adsorción de proteínas, lo que hace que la proteína de fusión no pueda colgarse.

Observaciones:
(1) Cuando se usa por primera vez, si la concentración de imidazol requerida para la elución es incierta, se recomienda agregar 10 mmol / L, 20 mmol / L, 50 mmol / L, 100 mmol / L, 200 mmol / L, 500 mmol / L a el búfer inicial. El imidazol se eluyó y recogió de bajo a alto, respectivamente, y los resultados eluidos se identificaron mediante electroforesis SDS-PAGE.
(2) El imidazol es alcalino y el pH se ajusta con HCl después de preparar el tampón correspondiente.
(3) Bajar la elución del pH y eluir el agente quelante hará que los iones metálicos se caigan y los iones metálicos deben volver a quelarse antes del próximo uso.
(4) Condicionalmente, se puede realizar una elución lineal en gradiente de imidazol para determinar las condiciones de elución preferidas.
Para los métodos de elución anteriores, se deben agregar de 150 a 500 mmol / L de NaCl al tampón para eliminar el intercambio iónico.
5.Regeneración
(1) El gel debe eliminarse y regenerarse después de un uso repetido o cuando sea necesario reemplazar los iones metálicos quelados. Método de eliminación de níquel: en primer lugar, enjuague la columna con 5 a 10 volúmenes de lecho de agua destilada, luego enjuague la columna con 5 a 10 volúmenes de lecho de 100 mmol / L de EDTA y, finalmente, utilice 2 a 3 volúmenes de lecho de lavados de 0,5 mol / L de NaCl. eliminar el EDTA residual.
(2) Por lo general, la columna utilizada varias veces debe limpiarse después de la eliminación del níquel. Método de limpieza: invierta la columna con 0.1 ~ 1.0 mol / L NaOH, manténgala a 50 cm / h durante 1 ~ 2 h, no solo puede eliminar las impurezas fuertes, sino que también elimina la fuente de calor.
(3) Requelación de iones metálicos después de la limpieza. Método de quelación: en primer lugar, la columna después de la eliminación del níquel se equilibra completamente con 2 a 5 volúmenes de lecho de agua destilada, y luego se usa una solución de sal metálica de 0,1 a 0,3 mol / L para pasar de 5 a 10 volúmenes de lecho para quelar iones metálicos. Enjuague con 5 a 10 volúmenes de lecho de agua destilada para eliminar los iones metálicos no quelados.
6.CIP
(1) Eliminación de proteínas adsorbidas por intercambio iónico: se lavaron de nuevo de 2 a 3 volúmenes de lecho con una solución de NaCl 2 mol / l.
(2) Eliminación de proteínas y lípidos hidrófobos fuertes, etc .: Se lavaron 4 volúmenes de lecho con etanol al 70% o isopropanol al 30%.
(3) Eliminación de proteína precipitada, proteína hidrófoba: paso de regeneración del gel de referencia.
7.Almacenamiento
Sellado y almacenado a 4 ~ 30 ° C (etanol al 20% en solución de almacenamiento), seco, ventilado, limpio, no congelado; Las columnas usadas se almacenan en una solución de etanol al 20% a 4 ~ 8 ° C.

Precaución:
(1) La muestra y Ni seplife®6FF (IDA) deben equilibrarse con el tampón de elución y luego pasar a la columna de cromatografía.
(2) El lecho de la columna debe ser plano, libre de ranuras y burbujas de aire; de ​​lo contrario, debe reinstalarse.
(3) Al usar, asegúrese de que la temperatura de la columna y el tampón sean iguales, evitando la generación de burbujas en el lecho de la columna y afectando el efecto de purificación.
(4) El caudal debe controlarse estrictamente durante el proceso de elución y no demasiado rápido.
(5) Durante la carga y todo el proceso de elución, se evita que la superficie del cilindro se seque.