Resina de cromatografía de agarosa con níquel
NI SEPLIFE 6FF (IDA) Instrucciones
NI SEPLIFE® 6FF (IDA) Afinidad Perfil de producto de medios cromatográficos:
Cromatografía de agarosa quelante de NI (IDA) es unir el ácido iminodiacético en los medios de agarosa 6FF y luego quelando el ion de Ni2+ ser como un Medios cromatográficos de afinidad. Se usa ampliamente para el Procesamiento de proteínas, ácido nucleico y purificación de polipéptidos en la corriente hacia abajo de biofarming y bioingeniería.
NI SEPLIFE® 6FF (IDA) Afinidad Parámetros de resina de medios cromatográficos:
| Código de resina | NI SEPLIFE® 6FF (IDA) |
| Apariencia | Cuentas de gel de la esfera |
| Tamaño de partícula (μm) | 45 ～ 165 |
| Matriz | SePlife 6ff |
| Caudal (cm/h) | ≥370 |
| Presión (MPA) | 0.3 |
| Capacidad de unión a iones | (Ni2+ umol/ml): ~ 15 |
| Caudal lineal de referencia | 60 cm/h |
| estabilidad de pH | 3 ~ 13 (a largo plazo), 2 ~ 14 (a corto plazo, CIP) |
| Solicitud | Purificación de proteínas de etiqueta His |
| Estabilidad química | Estable en solución de tampón de agua, 0.1mol/L NaOH; 0.01mol/L HCl;
8 mol/l carbamida |
NI SEPLIFE® 6FF (IDA) Instrucción de prueba de medios cromatográficos de afinidad:
1. Embalaje de columna
(1) Todo el material y el reactivo a temperatura ambiente, preparando el tampón inicial y la elución Beffer.
(2) Tome la muestra de resina según el tamaño de la columna, lave el etanol al 20% para que se seque, use el tampón (la relación de resina: tampón = 3: 1) para convertir en el tratamiento de homogeneizado y desgasificación.
(3) Use agua o tampón para mantener el interior o la parte inferior de la columna húmeda, el nivel de agua o amortiguador debe ser más alto que la mamá del filtro y asegúrese de que la parte inferior de la columna sin bobble.
(4) Use la varilla de vidrio para guiar el homogeneizado en la columna junto con la cara interna de la columna una vez para evitar cualquier burbuja. Abra la válvula de salida de la columna para hacer que la resina se ajuste libremente, y conecte bien la tapa superior de la columna.
(5) Abra la bomba peristáltica, use el tampón para pasar a través de la columna a una tasa de flujo de 1.33 veces que la velocidad de flujo del tampón normal usando. Use el búfer de 2-3bv para hacer el equilibrio de la columna.
2.Equilibro
Balancee con 2 ~ 5 volúmenes de solución de tampón inicial hasta que la conductividad, el pH y otros parámetros no cambien.
3. Carga de muestra
(1) La muestra generalmente se disuelve en el tampón inicial del pH 6-8, y aumentar el pH del tampón de carga puede aumentar la carga.
(2) El búfer no debe contener EDTA y citrato, y es mejor evitar reducir agentes como mercaptoetanol y DTT.
(3) La solución tampón de uso común tiene una solución tampón fosfato de sodio de 10 a 100 mmol/L, solución tampón de tampón de 20 a 200 mmol/LTRIS-HCL.
(4) 0.15 a 0.5 mol/L de NaCl generalmente se agrega al tampón para eliminar el intercambio de iones.
(5) Cuando se usa un gel de agarosa de quelato de níquel por primera vez, se recomienda usar 50 mmol/L PBS (50 mmol/L NAH2PO4, 0.5 mol/L NaCl, pH 7,4) como el tampón inicial.
4.Elución
La elución generalmente se divide en los siguientes métodos:
(1) Reduzca la elución del pH: la mayoría de las proteínas se eluirán a pH 6-4 (también a pH 3-4), y el tampón puede ser acetato de sodio, ácido cítrico y sistemas de tampón fosfato.
(2) Elución competitiva: aumentando o aumentando linealmente la concentración de sustancias competitivas con afinidad con iones metálicos (por ejemplo, 0-0.5 mol/l de imidazol, 0-50 mmol/L de histidina, 0-2 mol/L NH4CL).
(3) Eleución del agente quelante: los agentes quelantes como EDTA y EGTA pueden reaccionar con iones metálicos para hacer que la proteína elude. Sin embargo, este método no puede separar diferentes proteínas y afecta la adsorción de proteínas, lo que resulta en la incapacidad de la proteína de fusión para colgar.
NI SEPLIFE® 6FF (IDA) Afinidad Medios cromatográficos Observaciones:
(1) Cuando se usa por primera vez, si la concentración de imidazol requerida para la elución es incierta, se recomienda agregar 10 mmol/L, 20 mmol/L, 50 mmol/L, 100 mmol/L, 200 mmol/L, 500 mmol/L a el búfer inicial. El imidazol se eluyó y recolectó de bajo a alto, respectivamente, y los resultados eluidos se identificaron mediante electroforesis SDS-PAGE.
(2) El imidazol es alcalino, y el pH se ajusta con HCl después de prepararse el tampón correspondiente.
(3) Reducir la elución de pH y eluir al agente quelante hará que los iones metálicos se caigan, y los iones metálicos deben volver a colocarse antes del próximo uso.
(4) Condicionalmente, se puede realizar una elución lineal de gradiente de imidazol para determinar las condiciones de elución preferidas.
Para los métodos de elución anteriores, se deben agregar 150 a 500 mmol/L de NaCl al tampón para eliminar el intercambio de iones.
5. Regeneración
(1) El gel debe ser denick y regenerado después del uso repetido o cuando es necesario reemplazar los iones metálicos quelados. Método de eliminación de níquel: en primer lugar, enjuague la columna con volúmenes de agua destilados de 5 a 10 camas, luego enjuague la columna con volúmenes de 5 a 10 camas de 100 mmol/ L EDTA, y finalmente use volúmenes de 2 a 3 camas de NaCl de 0.5 mol/ L lejos edta residual.
(2) La columna utilizada para varias veces generalmente debe limpiarse después de la eliminación del níquel. Método de limpieza: invierta la columna con NaOH 0.1 ~ 1.0 mol/l, manténgala a 50 cm/h durante 1 ~ 2 h, no solo puede eliminar las fuertes impurezas, sino también eliminar la fuente de calor.
(3) Volver a expulsar los iones metálicos después de la limpieza. Método de quelación: en primer lugar, la columna después de la extracción del níquel se equilibra completamente con volúmenes de 2 a 5 camas de agua destilada, y luego se usa una solución de sal de metal de metal 0.1 a 0.3 mol/l para pasar de 5 a 10 volúmenes de camas para quelar iones metálicos. Enjuague con 5 a 10 camas volúmenes de agua destilada para eliminar los iones metálicos no seleccionados.
6.cip
(1) La extracción de proteínas adsorbidas por intercambio de iones: los volúmenes de 2 a 3 camas se lavaron por solución de NaCl de 2 mol/L.
(2) La extracción de proteínas hidrofóbicas fuertes y lípidos, etc.: los volúmenes de 4 camas se retrasaron con etanol al 70% o al 30% de isopropanol.
(3) Eliminación de proteína precipitada, proteína hidrofóbica: paso de regeneración de gel de referencia.
7.macenaje
Sellado y almacenado a 4 ~ 30 ° C (etanol al 20% en solución de almacenamiento), seco, ventilado, limpio, no congelado; Las columnas usadas se almacenan en 4 ~ 8 ° C, solución de etanol al 20%.
Precaución:
(1) La muestra y el Ni Seplife®6ff (IDA) deben ser equilibrado con el amortiguador de elución y luego ir a la columna de cromatografía.
(2) El lecho de la columna debe estar plano, libre de surcos y burbujas de aire, de lo contrario, debe reinstalarse.
(3) Al usar, asegúrese de que la temperatura de la columna y el tampón sean las mismas, evitando la generación de burbujas en el lecho de la columna y afectando el efecto de purificación.
(4) El caudal debe controlarse estrictamente durante el proceso de elución, y no demasiado rápido.
(5) Durante la carga y todo el proceso de elución, se evita que la superficie del cilindro se seque.
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